学习要求
1.了解微生物生长的营养物质及生理功能。
2.掌握培养基的概念、类型、配制原则和方法。
3.掌握高压蒸气灭菌锅的灭菌原理。
4.学会使用高压灭菌锅对培养基进行湿热灭菌。
5.学会培养基的制备技术。
知识准备
一、微生物的营养
（一）微生物细胞的化学组成
微生物细胞的化学成分以有机物和无机物两种状态存在。有机物包含各种大分子，它们是蛋白质、核酸、类脂和糖类，占细胞干重的99%。无机成分包括小分子无机物和各种离子，占细胞干重的1%。
微生物细胞的元素构成由C、H、O、N、P、S、K、Na、Mg、Ca、Fe、Mn、Cu、Co、Zn、Mo等组成，其中C、H、O、N、P、S六种元素占微生物细胞干重的97%，其他为微量元素。微生物细胞的化学元素组成的比例常因微生物种类的不同而各异。
组成微生物细胞的化学元素分别来自微生物生长所需要的营养物质，即微生物生长所需的营养物质应该包含有组成细胞的各种化学元素。这些物质概括为提供构成细胞物质的碳素来源的碳源物质，构成细胞物质的氮素来源的氮源物质和一些含有K、Na、Mg、Ca、Fe、Mn、Cu、Co、Zn、Mo元素的无机盐。
（二）营养物质及其生理功能
微生物生长所需要的营养物质主要是以有机物和无机物的形式提供的，小部分由气体物质供给。微生物的营养物质按其在机体中的生理作用可区分为：碳源、氮源、无机盐、生长因子和水五大类。
1.碳源
在微生物生长过程中为微生物提供碳素来源的物质称为碳源（carbon source）。
从简单的无机含碳化合物如CO2和碳酸盐到各种各样的天然有机化合物都可以作为微生物的碳源，但不同微生物利用含碳物质具有选择性，利用能力也有差异（表4－1）。
表4－1 微生物利用的碳源物质
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碳源的生理作用主要有：碳源物质通过复杂的化学变化来构成微生物自身的细胞物质和代谢产物；同时多数碳源物质在细胞内生化反应过程中还能为机体提供维持生命活动的能量，但有些以CO2为唯一或主要碳源的微生物生长所需的能源则不是来自CO2。
2.氮源
凡是可以被微生物用来构成细胞物质的或代谢产物中氮素来源的营养物质统称为氮源（nitrogen source）。
能被微生物所利用的氮源物质有蛋白质及其各类降解产物、铵盐、硝酸盐、亚硝酸盐、分子态氮、嘌呤、嘧啶、脲、酰胺、氰化物（表4－2）。
表4－2 微生物利用的氮源物质
氮源物质常被微生物用来合成细胞中含氮物质，少数情况下可作能源物质，如某些厌氧微生物在厌氧条件下可利用某些氨基酸作为能源。
微生物对氮源的利用具有选择性，如玉米浆相对于豆饼粉，
相对于
为速效氮源。铵盐作为氮源时会导致培养基pH下降，称为生理酸性盐，而以硝酸盐作为氮源时培养基pH会升高，称为生理碱性盐。
3.能源
能为微生物生命活动提供最初能量来源的营养物或辐射能，称为能源（energy source）。由于各种异养微生物的能源就是其碳源，因此，它们的能源谱就显得十分简单。
化能自养微生物的能源十分独特，它们都是一些还原态的无机物质，例如
、
、S、H2S、H2和Fe2+等。能利用这种能源的微生物都是一些原核生物，包括亚硝酸细菌、硝酸细菌、硫化细菌、硫细菌、氢细菌和铁细菌等。
一部分微生物能够利用辐射能（光能）进行光合作用获得能源，称为光能营养型。
在能源中，更容易理解的是，某一具体营养物质可同时兼有几种营养要素功能。例如光辐射能是单功能营养物（能源）；还原态的
是双功能营养物（能源和氮源）；而氨基酸是三功能的营养物（碳源、能源和氮源）。
4.无机盐
无机盐（inorganic salt）是微生物生长必不可少的一类营养物质，它们在机体中的生理功能主要是作为酶活性中心的组成部分、维持生物大分子和细胞结构的稳定性、调节并维持细胞的渗透压平衡、控制细胞的氧化还原电位和作为某些微生物生长的能源物质等（表4－3）。
表4－3 无机盐及其生理功能
微生物生长所需的无机盐一般有磷酸盐、硫酸盐、氯化物以及含有钠、钾、钙、镁、铁等金属元素的化合物。
在微生物的生长过程中还需要一些微量元素，微量元素是指那些在微生物生长过程中起重要作用，而机体对这些元素的需要量极其微小的元素，通常需要量在10－8～10－6mol/L（培养基中含量）。微量元素一般参与酶的组成或使酶活化（表4－4）。
表4－4 微量元素与生理功能
如果微生物在生长过程中缺乏微量元素，会导致细胞生理活性降低甚至停止生长。由于不同微生物对营养物质的需求不尽相同，微量元素这个概念也是相对的。微量元素通常混杂在天然有机营养物、无机化学试剂、自来水、蒸馏水、普通玻璃器皿中，如果没有特殊原因，在配制培养基时没有必要另外加入微量元素。值得注意的是，许多微量元素是重金属，如果它们过量，就会对机体产生毒害作用，而且单独一种微量元素过量产生的毒害作用更大，因此有必要将培养基中微量元素的量控制在正常范围内，并注意各种微量元素之间保持恰当比例。
5.生长因子
生长因子（growth factor）通常指那些微生物生长所必需而且需要量很小，但微生物自身不能合成或合成量不足以满足机体生长需要的有机化合物。
根据生长因子的化学结构和它们在机体中的生理功能的不同，可将生长因子分为维生素、氨基酸、嘌呤与嘧啶三大类（表4－5）。维生素在机体中所起的作用主要是作为酶的辅基或辅酶参与新陈代谢；有些微生物自身缺乏合成某些氨基酸的能力，因此必须在培养基中补充这些氨基酸或含有这些氨基酸的小肽类物质，微生物才能正常生长；嘌呤与嘧啶作为生长因子，在微生物机体内的作用主要是作为酶的辅酶或辅基，以及用来合成核苷、核苷酸和核酸。
表4－5 维生素及其在代谢中的作用
6.水
水是微生物生长所必不可少的，在细胞中的生理功能主要有：①起到溶剂与运输介质的作用，营养物质的吸收与代谢产物的分泌必须以水为介质才能完成；②参与细胞内一系列化学反应；③维持蛋白质、核酸等生物大分子稳定的天然构象；④因为水的比热高，是热的良好导体，能有效地吸收代谢过程中产生的热并及时地将热迅速散发出体外，从而有效地控制细胞内温度的变化；⑤保持充足的水分是细胞维持自身正常形态的重要因素；⑥微生物通过水合作用与脱水作用控制由多亚基组成的结构，如酶、微管、鞭毛及病毒颗粒的组装与解离。
微生物生长的环境中水的有效性常以水分活度（wateractivity，Aw）表示，水分活度是指在一定的温度和压力条件下，溶液的蒸气压力与同样条件下纯水蒸气压力之比，即Aw＝Pw/P0w，式中Pw代表溶液蒸气压力，P0w代表纯水蒸气压力。纯水Aw为1.00，溶液中溶质越多，Aw越小。微生物一般在Aw为0.60～0.99的条件下生长，Aw过低时，微生物生长的迟缓期延长，比生长速率和总生长量减少。微生物不同，其生长的最适Aw不同（表4－6）。一般而言，细菌生长最适Aw较酵母菌和霉菌高，而嗜盐微生物生长最适Aw则较低。
表4－6 几类微生物生长最适Aw
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二、培养基
微生物的生长和繁殖需要一定的营养物质，根据微生物对营养物质的需要，经过人工配制适合不同微生物生长、繁殖或积累代谢产物的营养基质就称为培养基。培养基的主要用途为：促使微生物生长与繁殖，用于微生物纯种分离、鉴定和制造微生物制品等。
把一定的培养基放入一定的器皿中，就提供了人工繁殖微生物的环境和场所。它含有满足微生物生长发育的水分、碳源、氮源、无机盐和生长素以及某些特需的微量元素等。培养基还应具有适宜的酸碱度（pH）和一定缓冲能力，及一定的氧化还原电位和合适的渗透压。
（一）培养基的类型
培养基有液体、半固体或固体形式，包含天然或合成成分，用于促进微生物的繁殖或保持其活力。由于各类微生物对营养的要求不同，培养目的和检测需要不同，因而培养基可根据某种标准，划分为若干类型。
培养基种类繁多，根据其成分、物理状态和用途可将培养基分成多种类型。
1.按成分不同划分
（1）天然培养基（natural medium）天然培养基是利用各种动、植物或微生物等天然有机物原料配制而成的营养成分丰富、培养效果好、来源广泛的培养基。
常用的天然有机营养物质包括牛肉浸膏、蛋白胨、酵母浸膏（表4－7）、豆芽汁、麦芽汁、玉米粉、土壤浸液、麸皮、牛乳、血清、稻草浸汁、羽毛浸汁、胡萝卜汁、椰子汁、各种饼粉、马铃薯等，嗜粪微生物（coprophilous microorganisms）可以利用粪水作为营养物质。天然培养基成本较低，除在实验室经常使用外，也适于用来进行工业上大规模的微生物发酵生产。
这类培养基含有化学成分还不清楚或化学成分不恒定的天然有机物，也称非化学限定培养基（chemically undefined medium）。牛肉膏蛋白胨培养基和麦芽汁培养基就属于此类。基因克隆技术中常用的LB（Luria－Bertani）培养基也是一种天然培养基，其组成见表4－8。
表4－7 牛肉浸膏、蛋白胨及酵母浸膏的来源及主要成分
表4－8 几种类型培养基的组成
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（2）合成培养基（synthetic medium）合成培养基是一类化学成分和数量完全知道的培养基，它是用已知化学成分的化学药品配制而成。
这类培养基化学成分精确，也称化学限定培养基（chemically defined medium），高氏1号培养基和查氏培养基就属于此种类型。配制合成培养基时重复性强，但与天然培养基相比其成本较高，微生物在其中生长速度较慢，一般适于在实验室用来进行有关微生物营养需求、代谢、分类鉴定、生物量测定、菌种选育及遗传分析等方面的研究工作。
（3）半合成培养基（semi－composed culture medium）在合成培养基中，加入某种或几种天然成分；或者在天然培养基中，加入一种或几种已知成分的化学药品即成半合成培养基。例如常用的马铃薯蔗糖培养基就属于此类型，这种培养基在生产实践和实验室中使用最多。
2.根据物理状态划分
根据培养基中凝固剂的有无及含量的多少，可将培养基划分为固体培养基、半固体培养基和液体培养基三种类型。
（1）固体培养基（solid medium）在液体培养基中加入一定量凝固剂，使其成为固体状态即为固体培养基。理想的凝固剂应具备以下条件：①不被所培养的微生物分解利用；②在微生物生长的温度范围内保持固体状态，在培养嗜热细菌时，由于高温容易引起培养基液化，通常在培养基中适当增加凝固剂来解决这一问题；③凝固剂凝固点温度不能太低，否则将不利于微生物的生长；④凝固剂对所培养的微生物无毒害作用；⑤凝固剂在灭菌过程中不会被破坏；⑥透明度好，黏着力强；⑦配制方便且价格低廉。常用的凝固剂有琼脂、明胶和硅胶。其中以琼脂最为常用，其主要成分为多糖类物质，性质较稳定，一般微生物不能分解，故用作凝固剂而不致引起化学成分变化。琼脂在95℃的热水中才开始熔化，熔化后的琼脂冷却到45℃才重新凝固。因此用琼脂制成的固体培养基在一般微生物的培养温度范围内（25～37℃）不会熔化而保持固体状态。
对绝大多数微生物而言，琼脂是最理想的凝固剂，琼脂是由藻类（海产石花菜）中提取的一种高度分支的复杂多糖；明胶是由胶原蛋白制备得到的产物，是最早用来作为凝固剂的物质，但由于其凝固点太低，而且某些细菌和许多真菌产生的非特异性胞外蛋白酶以及梭菌产生的特异性胶原酶都能液化明胶，目前已较少作为凝固剂；硅胶是由无机的硅酸钠（Na2SiO3）及硅酸钾（K2SiO3）被盐酸及硫酸中和时凝聚而成的胶体，它不含有机物，适合配制分离与培养自养型微生物的培养基。如表4－9所示列出琼脂和明胶的一些主要特征。
表4－9 琼脂与明胶主要特征比较
除在液体培养基中加入凝固剂制备的固体培养基外，一些由天然固体基质制成的培养基也属于固体培养基。例如，由马铃薯块、胡萝卜条、小米、麸皮及米糠等制成固体状态的培养基就属于此类。又如生产酒的酒曲、生产食用菌的棉子壳培养基。
在实验室中，固体培养基一般是加入平皿或试管中，制成培养微生物的平板或斜面。固体培养基为微生物提供一个营养表面，单个微生物细胞在这个营养表面进行生长繁殖，可以形成单个菌落。固体培养基常用来进行微生物的分离、鉴定、活菌计数及菌种保藏等。
（2）半固体培养基（semisolid medium）半固体培养基中凝固剂的含量比固体培养基少，培养基中琼脂含量一般为0.2%～0.7%。半固体培养基常用来观察微生物的运动特征、分类鉴定及噬菌体效价滴定等，有时用来保藏菌种。
（3）液体培养基（liquid medium）液体培养基中未加任何凝固剂。在用液体培养基培养微生物时，通过振荡或搅拌可以增加培养基的通气量，同时使营养物质分布均匀。液体培养基常用于大规模工业生产以及在实验室进行微生物的基础理论和应用方面的研究。
3.按用途划分
（1）基础培养基（minimum medium）尽管不同微生物的营养需求各不相同，但大多数微生物所需的基本营养物质是相同的。基础培养基是含有一般微生物生长繁殖所需的基本营养物质的培养基。牛肉膏蛋白胨培养基是最常用的基础培养基。基础培养基也可以作为一些特殊培养基的基础成分，再根据某种微生物的特殊营养需求，在基础培养基中加入所需营养物质。
（2）加富培养基（enrichment medium）加富培养基也称营养培养基，即在基础培养基中加入某些特殊营养物质制成的一类营养丰富的培养基，这些特殊营养物质包括血液、血清、酵母浸膏、动植物组织液等。加富培养基一般用来培养营养要求比较苛刻的异养型微生物，如培养百日咳博德氏菌需要含有血液的加富培养基。加富培养基还可以用来富集和分离某种微生物，这是因为加富培养基含有某种微生物所需的特殊营养物质，该种微生物在这种培养基中较其他微生物生长速度快，并逐渐富集而占优势，逐步淘汰其他微生物，从而容易达到分离该种微生物的目的。从某种意义上讲，加富培养基类似选择培养基，两者区别在于，加富培养基是用来增加所要分离的微生物的数量，使其形成生长优势，从而分离到该种微生物；选择培养基则一般是抑制不需要的微生物的生长，使所需要的微生物增殖，从而达到分离所需微生物的目的。
（3）鉴别培养基（differential medium）鉴别培养基是用于鉴别不同类型微生物的培养基。在培养基中加入某种特殊化学物质，某种微生物在培养基中生长后能产生某种代谢产物，而这种代谢产物可以与培养基中的特殊化学物质发生特定的化学反应，产生明显的特征性变化，根据这种特征性变化，可将该种微生物与其他微生物区分开来。鉴别培养基主要用于微生物的快速分类鉴定，以及分离和筛选产生某种代谢产物的微生物菌种。常用的一些鉴别培养基参见表4－10。
表4－10 常用鉴别培养基
（4）选择培养基（selective medium）选择培养基是用来将某种或某类微生物从混杂的微生物群体中分离出来的培养基。根据不同种类微生物的特殊营养需求或对某种化学物质的敏感性不同，在培养基中加入相应的特殊营养物质或化学物质，抑制不需要的微生物的生长，有利于所需微生物的生长。
一种类型选择培养基是依据某些微生物的特殊营养需求设计的，例如，利用以纤维素或石蜡油作为唯一碳源的选择培养基，可以从混杂的微生物群体中分离出能分解纤维素或石蜡油的微生物；利用以蛋白质作为唯一氮源的选择培养基，可以分离产胞外蛋白酶的微生物；缺乏氮源的选择培养基可用来分离固氮微生物。另一种类型的选择培养基是在培养基中加入某种化学物质，这种化学物质没有营养作用，对所需分离的微生物无害，但可以抑制或杀死其他微生物，例如，在培养基中加入数滴10%酚可以抑制细菌和霉菌的生长，从而由混杂的微生物群体中分离出放线菌；在培养基中加入亚硫酸铵，可以抑制革兰阳性细菌和绝大多数革兰阴性细菌的生长，而革兰阴性的伤寒沙门菌（Salmomnella typhi）可以在这种培养基上生长；在培养基中加入染料亮绿或结晶紫，可以抑制革兰阳性细菌的生长，从而达到分离革兰阴性细菌的目的；在培养基中加入青霉素、四环素或链霉素，可以抑制细菌和放线菌生长，而将酵母菌和霉菌分离出来。现代基因克隆技术中也常用选择培养基，在筛选含有重组质粒的基因工程菌株过程中，利用质粒上具有的对某种（些）抗生素的抗性选择标记，在培养基中加入相应抗生素，就能比较方便地淘汰非重组菌株，以减少筛选目标菌株的工作量。
（5）其他 除上述四种主要类型外，培养基按用途划分还有很多种，比如：分析培养基（assay medium）常用来分析某些化学物质（抗生素、维生素）的浓度，还可用来分析微生物的营养需求；还原性培养基（reduced medium）专门用来培养厌氧型微生物；组织培养物培养基（tissue－culture medium）含有动、植物细胞，用来培养病毒、衣原体、立克次氏体及某些螺旋体等专性活细胞寄生的微生物。尽管如此，有些病毒和立克次氏体目前还不能利用人工培养基来培养，需要接种在动植物体内、动植物组织中才能增殖。常用的培养病毒与立克次氏体的动物有小白鼠、家鼠和琢鼠，鸡胚也是培养某些病毒与立克次氏体的良好营养基质，鸡瘟病毒、牛痘病毒、天花病毒、狂犬病毒等十几种病毒也可用鸡胚培养。
（二）培养基配制的原则
1.选择适宜的营养物质
总体而言，所有微生物生长繁殖均需要培养基含有碳源、氮源、无机盐、生长因子、水及能源，但由于微生物营养类型复杂，不同微生物对营养物质的需求是不一样的，因此首先要根据不同微生物的营养需求配制针对性强的培养基。自养型微生物能从简单的无机物合成自身需要的糖类、脂类、蛋白质、核酸、维生素等复杂的有机物，因此培养自养型微生物的培养基完全可以（或应该）由简单的无机物组成。例如，培养化能自养型的氧化硫硫杆菌（Thiobacillus thiooxdans）的培养基在配制过程中并未专门加入其他碳源物质，而是依靠空气中和溶于水中的CO2为氧化硫硫杆菌提供碳源。
就微生物主要类型而言，有细菌、放线菌、酵母菌、霉菌、原生动物、藻类及病毒之分，培养它们所需的培养基各不相同。在实验室中常用牛肉膏蛋白胨培养基（或简称普通肉汤培养基）培养细菌，用高氏1号合成培养基培养放线菌，培养酵母菌一般用麦芽汁培养基，培养霉菌则一般用查氏合成培养基。
2.营养物质浓度及配比合适
培养基中营养物质浓度合适时微生物才能生长良好，营养物质浓度过低时不能满足微生物正常生长所需，浓度过高时则可能对微生物生长起抑制作用，例如高浓度糖类物质、无机盐、重金属离子等不仅不能维持和促进微生物的生长，反而起到抑菌或杀菌作用。另外，培养基中各营养物质之间的浓度配比也直接影响微生物的生长繁殖和（或）代谢产物的形成和积累，其中碳氮比（C/N）的影响较大。严格地讲，碳氮比指培养基中碳元素与氮元素的物质的量比值，有时也指培养基中还原糖与粗蛋白之比。例如，在利用微生物发酵生产谷氨酸的过程中，培养基碳氮比为4∶1时，菌体大量繁殖，谷氨酸积累少；当培养基碳氮比为3∶1时，菌体繁殖受到抑制，谷氨酸产量则大量增加。再如，在抗生素发酵生产过程中，可以通过控制培养基中速效氮（或碳）源与迟效氮（或碳）源之间的比例来控制菌体生长与抗生素的合成协调。
3.控制pH条件
培养基的pH必须控制在一定的范围内，以满足不同类型微生物的生长繁殖或产生代谢产物。各类微生物生长繁殖或产生代谢产物的最适pH条件各不相同，一般来讲，细菌与放线菌适于在pH7～7.5生长，酵母菌和霉菌通常在pH4.5～6生长。值得注意的是，在微生物生长繁殖和代谢过程中，由于营养物质被分解利用和代谢产物的形成与积累，会导致培养基pH发生变化，若不对培养基pH条件进行控制，往往导致微生物生长速度下降或（和）代谢产物产量下降。因此，为了维持培养基pH的相对恒定，通常在培养基中加入pH缓冲剂，常用的缓冲剂是一氢和二氢磷酸盐（如KH2PO4和K2HPO4）组成的混合物。K2HPO4溶液呈碱性，KH2PO4溶液呈酸性，两种物质的等量混合溶液的pH为6.8。当培养基中酸性物质积累导致H+浓度增加时，H+与弱碱性盐结合形成弱酸性化合物，培养基pH不会过度降低；如果培养基中OH－浓度增加，OH－则与弱酸性盐结合形成弱碱性化合物，培养基pH也不会过度升高。
但KH2PO4和K2HPO4缓冲系统只能在一定的pH范围内（pH6.4～7.2）起调节作用。有些微生物，如乳酸菌能大量产酸，上述缓冲系统就难以起到缓冲作用，此时可在培养基中添加难溶的碳酸盐（如CaCO3）来进行调节，CaCO3难溶于水，不会使培养基pH过度升高，但它可以不断中和微生物产生的酸，同时释放出CO2，将培养基pH控制在一定范围内。
在培养基中还存在一些天然的缓冲系统，如氨基酸、肽、蛋白质都属于两性电解质，也可起到缓冲剂的作用。
4.控制氧化还原电位
不同类型微生物生长对氧化还原电位（Φ）的要求不一样，一般好氧性微生物在Φ值为+0.1V以上时可正常生长，一般以+0.3～+0.4V为宜，厌氧性微生物只能在Φ值低于+0.1V条件下生长，兼性厌氧微生物在Φ值为+0.1V以上时进行好氧呼吸，在+0.1V以下时进行发酵。Φ值与氧分压和pH有关，也受某些微生物代谢产物的影响。在pH相对稳定的条件下，可通过增加通气量（如振荡培养、搅拌）提高培养基的氧分压，或加入氧化剂，从而增加Φ值；在培养基中加入抗坏血酸、硫化氢、半胱氨酸、谷胱甘肽、二硫苏糖醇等还原性物质可降低Φ值。
5.原料来源的选择
在配制培养基时应尽量利用廉价且易于获得的原料作为培养基成分，特别是在发酵工业中，培养基用量很大，利用低成本的原料更体现出其经济价值。例如，在微生物单细胞蛋白的工业生产过程中，常常利用糖蜜（制糖工业中含有蔗糖的废液）、乳清（乳制品工业中含有乳糖的废液）、豆制品工业废液及黑废液（造纸工业中含有戊糖和己糖的亚硫酸纸浆）等都可作为培养基的原料。再如，工业上的甲烷发酵主要利用废水、废渣作原料，而在我国农村，已推广利用人畜粪便及禾草为原料发酵生产甲烷作为燃料。另外，大量的农副产品或制品，如麸皮、米糠、玉米浆、酵母浸膏、酒糟、豆饼、花生饼、蛋白胨等都是常用的发酵工业原料。
6.灭菌处理
要获得微生物纯培养，必须避免杂菌污染，因此需要对所用器材及工作场所进行消毒与灭菌。对培养基而言，更是要进行严格的灭菌。对培养基一般采取高压蒸汽灭菌，一般培养基用1.05kg/cm2，121.3℃条件下维持15～30min可达到灭菌目的。在高压蒸汽灭菌过程中，长时间高温会使某些不耐热物质遭到破坏，如使糖类物质形成氨基糖、焦糖，因此含糖培养基常在0.56kg/cm2，112.6℃ 15～30min进行灭菌，某些对糖类要求较高的培养基，可先将糖进行过滤除菌或间歇灭菌，再与其他已灭菌的成分混合；长时间高温还会引起磷酸盐、碳酸盐与某些阳离子（特别是钙、镁、铁离子）结合形成难溶性复合物而产生沉淀，因此，在配制用于观察和定量测定微生物生长状况的合成培养基时，常需在培养基中加入少量螯合剂，避免培养基中产生沉淀，常用的螯合剂为乙二胺四乙酸（EDTA）。还可以将含钙、镁、铁等离子的成分与磷酸盐、碳酸盐分别进行灭菌，然后再混合，避免形成沉淀；高压蒸汽灭菌后，培养基pH会发生改变（一般使pH降低），可根据所培养微生物的要求，在培养基灭菌前后加以调整。在配制培养基过程中，泡沫的存在对灭菌处理极不利，因为泡沫中的空气形成隔热层，使泡沫中微生物难以被杀死，因而有时需要在培养基中加入消泡沫剂以减少泡沫的产生。
三、灭菌的概念及类型
（一）灭菌与消毒的区别
灭菌是指采用物理、化学和生物的方法杀灭一切微生物的营养体、芽孢和孢子的过程。
消毒是指杀死病原微生物但不一定能杀死细菌芽孢的方法。通常用化学的方法来达到消毒的作用。(www.zuozong.com)
在微生物实验中，不能有任何杂菌污染，因此对所用器材、培养基和工作场所都要进行严格的消毒和灭菌。
（二）灭菌的类型
高温灭菌分为干热灭菌和湿热灭菌。
1.干热灭菌
干热灭菌主要用于玻璃器皿和金属器械的灭菌。
（1）火焰灭菌 直接利用火焰燃烧杀灭微生物。该方法灭菌迅速、彻底。
（2）加热空气灭菌 将空气加热达140～160℃，保持1～2h。
2.湿热灭菌
（1）煮沸灭菌 煮沸温度接近100℃，保持15～30min，可杀死微生物的营养体，若要杀死芽孢，则需要2～3h，此法适用于可以浸泡在水中的物品，如食品、器材、衣物等。
（2）间歇灭菌 用蒸汽加热灭菌温度不超过100℃，每日一次，每次加热30min，连续三次。
（3）巴氏消毒 有些食品或物品在高温下会受到不同程度的损害，不宜用过高的温度灭菌，可采用较低的温度进行灭菌，条件是62～63℃，30min；或72℃，15s。适用于杀死食品中的病原菌。
（4）高压蒸汽灭菌 1kg/cm2，121.5℃，15～30min。
（5）超高温瞬时杀菌法 灭菌温度132～150℃，3～5s，可杀死微生物的营养细胞和耐热性强的芽孢细菌，但污染严重的鲜乳在142℃以上杀菌效果才好。
材料用具
接种环、酒精灯、接种箱、琼脂、10%HCl、10%NaOH、牛肉膏、蛋白胨、试管、量筒、小烧杯、玻璃棒、骨匙、pH试纸、纱布、棉花、报纸、棉绳、标签、培养皿、高压灭菌锅、烘箱、电炉等。
任务实施
一、培养基的一般制备流程
原料称量→溶解→（加琼脂熔化）→调节pH→分装→塞棉塞和包扎→灭菌→摆放斜面或倒平板。
1.原料称量、溶解
根据培养基配方，准确称取各种原料成分，在容器中加所需水量的一半，然后依次将各种原料加入水中，用玻璃棒搅拌使之溶解。某些不易溶解的原料如蛋白胨、牛肉膏等可事先在小容器中加少量水，加热溶解后再冲入容器中。有些原料需用量很少，不易称量，可先配成高浓度的溶液按比例换算后取一定体积的溶液加入容器中。待原料全部放入容器后，加热使其充分溶解，并补足需要的全部水分，即成液体培养基。
配制固体培养基时，预先将琼脂称好（粉状琼脂可直接加入，条状琼脂用剪刀剪成小段，以便熔化），然后将液体培养基煮沸，再把琼脂放入，继续加热至琼脂完全熔化。在加热过程中应注意不断搅拌，以防琼脂沉淀在锅底烧焦，并应控制火力，以免培养基因暴沸而溢出容器。待琼脂完全熔化后，再用热水补足因蒸发而损失的水分。
2.调节pH
液体培养基配好后，一般要调节至所需的pH，常用一定浓度的盐酸及氢氧化钠溶液进行调节。调节培养基酸碱度最简单的方法是用精密pH试纸进行测定，用玻璃棒蘸少许培养基，点在试纸上进行对比。如pH偏酸，则加3%氢氧化钠溶液，偏碱则加3%盐酸溶液，经反复几次调节至所需pH。此法简便快速，但难于精确。要准确调节培养基的pH可用酸度计进行。
固体培养基酸碱度的调节，与液体培养基相同。一般在加入琼脂后进行。进行调节时，应注意将培养基温度保持在80℃以上，以防因琼脂凝固影响调节操作。
3.分装
培养基配好后，要根据不同的使用目的，分装到各种试管或锥形瓶中。
试管分装时取玻璃漏斗一个，装在铁架上，漏斗下连一根橡皮管与另一玻璃管嘴相连，橡皮管上加一弹簧夹。分装时，用左手拿住空试管中部，并将漏斗下的玻璃管嘴插入试管内，以右手拇指及食指开放弹簧夹，中指及无名指夹住玻璃管嘴，使培养基直接流入试管内，如图4－1。
图4－1 培养基的分装
1—铁架台 2—漏斗 3—乳胶管4—弹簧夹 5—试管
装入试管的培养基视试管大小及需要而定。如液体则分装至试管高度的1/4左右为宜；如固体则分装量为管高的1/5；如为半固体培养基，则分装至试管1/3～1/2的高度为宜。用三角瓶分装培养基时，容量以不超过容积的一半为宜。
4.高压蒸汽灭菌
高压蒸汽灭菌的原理是基于水在煮沸时所形成的蒸汽不能扩散到外面去，而聚集在密封的容器中，在密闭的情况下，随着水的煮沸，蒸汽压力升高，温度也相应增高，得到100℃以上的高温，导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。
高压蒸汽灭菌锅用途广，适用于医疗卫生事业、科研、农业等单位，对医疗器械、玻璃器皿、溶液培养基等进行消毒灭菌，是微生物学实验中最常用的灭菌方法。
高压灭菌器的主要构成部分是：灭菌锅、盖、压力表、放气阀、安全阀等，如图4－2所示，操作过程见表4－11。
图4－2 高压蒸汽灭菌锅
表4－11 高压蒸汽灭菌锅的操作过程
续表
5.摆放斜面或倒平板
已灭菌的固体培养基要趁热制作斜面试管和固体平板。
（1）斜面培养基的制作方法 需做斜面的试管，斜面的斜度要适当，使斜面的长度不超过试管长度的1/2（图4－3）。摆放时注意不可使培养基沾污棉塞，冷凝过程中勿再移动试管。制得的斜面以稍有凝结水析出者为佳。待斜面完全凝固后，再进行收存。制作半固体或固体深层培养基时，灭菌后则应垂直放置至冷凝。
（2）平板培养基的制作方法 将已灭菌的琼脂培养基（装在锥形瓶或试管中）熔化后，待冷却至50℃左右倾入无菌培养皿中。温度过高时，易在皿盖上形成太多冷凝水；低于45℃时，培养基易凝固。操作时最好在超净工作台酒精灯火焰旁进行，左手拿培养皿，右手拿锥形瓶的底部或试管，同时用小指和手掌将棉塞打开，灼烧瓶口，用左手大拇指将培养皿盖打开一缝，至瓶口刚好伸入，倾入培养基12～15mL，平置（图4－4）凝固后备用（一般平板培养基的高度约3mm）。
图4－3 培养基斜面试管的摆放
图4－4 平板培养基制作法
6.无菌检查
灭菌后的培养基，一般需进行无菌检查。最好从中取出1～2管（瓶），置于30～37℃恒温箱中保温培养1～2d，如发现有杂菌生长，应及时再次灭菌，以保证使用前的培养基处于绝对无菌状态。
正确制备培养基是微生物检验的一个基本步骤。使用商品化脱水合成培养基制备培养基时，应严格按照厂商提供的使用说明配制，如质量（体积）、pH、制备条件、灭菌条件、操作步骤等。当使用独立成分制备培养基时，按配方准确配制并记录所有配制步骤。另外，记录所有使用成分的特性（如代号和批号等）。
二、几种常用培养基的配制
1.牛肉膏蛋白胨培养基的制备
（1）原理 牛肉膏蛋白胨培养基是细菌学研究最常用的天然培养基。在配方中不加琼脂时称之为肉汤培养基。加入琼脂配制的固体培养基一般用于细菌的分离、培养和测数等。
（2）培养基配方 牛肉膏5.0g、蛋白胨10.0g、NaCl 5.0g、琼脂20.0g、水1000mL、pH7.0。
（3）操作步骤
①在100mL小烧杯中称取牛肉膏5.0g、蛋白胨10.0g，加50mL水，置电炉搅拌加热至牛肉膏、蛋白胨完全溶解。
②向小铝锅中加入500mL水，将溶解的牛肉膏、蛋白胨倒入铝锅中并用自来水洗2～3次。加入5.0g NaCl，在电炉上边加热边搅拌。
③加入洗净的琼脂条，继续搅拌，加热至琼脂完全熔化，补足水量至1000mL。
④用玻璃棒沾少许液体，用pH试纸测定pH。用NaOH或HCl调至pH7.0。
⑤分装漏斗分装于10mm ×180mm试管中，塞好棉塞，装入小铁丝筐，然后用旧报纸将棉塞部分包好。
⑥高压蒸汽灭菌，121℃灭菌30min。
⑦灭菌后摆放斜面。
2.高氏1号合成培养基的制备
（1）原理 高氏1号培养基是一个合成培养基，常用于分离和培养放线菌。
（2）培养基配方 可溶性淀粉20.0g、硝酸钾1.0g、K2HPO40.5g、MgSO4· 7H2O 0.5g、氯化钠0.5g、硫酸亚铁0.01g、琼脂20g、蒸馏水1000mL、pH7.2～7.4。
（3）操作步骤
①量取水500mL置于小铝锅中，在电炉上加热。
②根据培养基配方，依次称取各种药品加入搪瓷杯中，搅拌均匀。其中可溶性淀粉称入100mL烧杯中，加入50mL自来水调成糊状，待培养液沸腾时加入铝锅中，边加边搅拌，以防糊底。
③加入20g琼脂煮沸至熔化，补足1000mL水量，调pH7.2～7.4。
④趁热分装于18mm×180mm试管，斜面试管每管8mL，若倒平板则每管装15mL，装量根据需要而定。
⑤塞好棉塞，装入小铁丝筐，并用旧报纸将棉塞部分包好，贴好标签。
⑥高压蒸汽灭菌，121℃灭菌30min。
⑦若有斜面试管，在灭菌后及时摆放斜面。
3.马铃薯蔗糖琼脂培养基的制备
（1）原理 马铃薯蔗糖培养基是一种半合成培养基，常用于培养多种真菌。
（2）培养基成分 去皮的马铃薯200g、蔗糖或葡萄糖20g、琼脂20g、水1000mL、pH自然。
（3）操作步骤
①称取去皮新鲜马铃薯200g切成1cm见方的小块放于小铝锅中，加1000mL自来水，置于电炉上煮沸20min后，用双层纱布过滤。滤液计量体积后倒入小铝锅中煮沸。
②加入称好的蔗糖、琼脂，加热搅拌至琼脂完全熔化，并补足水量至1000mL。
③趁热用分装漏斗分装于18mm×180mm试管，斜面以8mL为宜，柱状15mL为宜。分装完毕后做好棉塞，装入小试管筐并捆好，写好标签。
④高压蒸汽灭菌，121℃灭菌30min。若需摆斜面，灭菌后趁热摆成斜面。
三、注意事项
（1）培养基分装时注意不要使培养基沾染管口或瓶口，以免浸湿棉塞，引起污染。
（2）培养基制备完毕后应立即进行高压蒸汽灭菌。如延误时间，会因杂菌繁殖生长，导致培养基变质而不能使用。特别是在气温高的情况下，如不及时进行灭菌，数小时内培养基就可能变质。若确实不能立即灭菌，可将培养基暂放于4℃冰箱或冰柜中，但时间也不宜过久。
（3）不同成分的培养基要采用不同的杀菌条件，如脱脂牛乳的杀菌采用55kPa 20min，因为过高的温度会使牛乳变色。
四、任务评价
培养基制备的评分标准见表4－12。
表4－12 培养基制备的评分标准
续表
五、实训报告
通过你所配制的培养基配制过程原始记录，简单说明培养基配制、分装过程中的关键操作点。
【问题思考】
1.培养基配好后为什么要立即灭菌？若不能及时灭菌应如何处理？如何检查灭菌后的培养菌是无菌的？
2.微生物实验所用瓶口、管口为什么都要塞上棉塞？棉塞的作用是什么？所用培养基及器皿接种前为什么均需经高压蒸汽灭菌？
3.分装培养基时为什么要使用弹簧夹？
4.培养基配制时应注意什么问题，为什么？
5.培养不同种类微生物能否用同一种培养基？培养细菌、放线菌、酵母菌、霉菌通常采用什么培养基？
6.干热灭菌和高压蒸汽法适用范围分别是什么？
7.加压蒸汽灭菌的原理是什么？是否只要压力表上的指针指到所需的压力时就能达到所需灭菌温度？
8.高压蒸汽灭菌时，为什么要排尽锅内的冷空气？
9.高压蒸汽灭菌为什么比干热灭菌要求温度低、时间短？
10.高氏1号培养基、牛肉膏蛋白胨培养基、马铃薯蔗糖琼脂培养基分别属于哪种类型的培养基？分别适合培养哪种微生物？
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