光学显微镜的物镜和目镜分析与介绍

光学显微镜的光学系统由物镜和目镜组成,物镜和目镜分别安装在金属镜筒的下端和上端。为了方便的更换物镜,在具有5～7个孔洞的物镜转换台上可以旋入不同放大倍数的一组物镜,显微镜正是借助物镜和目镜的两次放大作用来观察微小物体或物体的细微结构的。

图3.16　直筒形显微镜

图3.17　斜筒形显微镜

1—目镜;2—镜座(镜筒座);3—物镜转换器;4—物镜;5—镜柱(镜臂);6—机械移动载物台;7—粗准焦螺旋;8—细准焦螺旋;9—左、右移动尺;10—底光源;11—底座;12—底光源开关;13—夹片夹;14—通光孔;15—聚光镜

1)物镜

物镜的作用是将样品做第一次放大,形成样品的中间像。物镜是决定显微镜像的质量、分辨力和放大倍数的最关键的光学部件,一般由几个不同球面半径的透镜组合而成,放大倍数越高、矫正程度越高的物镜的构造越复杂。

(1)物镜的性能

各种物镜具有不同的光学性能,一般光学显微镜的物镜筒壁上都标刻着物镜的各种性能参数。现以图3.18所示的三个物镜为例,做简要说明。

如图3.18所示,物镜上刻了两行数字。第一行“/”前的“100”“40”“10”表示物镜的放大倍数分别为100倍、40倍、10倍;“/”后的“1.25”“0.65”“0.25”表示物镜的数值孔径分别为1.25、0.65、0.25,物镜的数值孔径越大,分辨本领越高;图3.18(a)“100”前的“S”和图3.18(c)“10”前和图3.18(d)中的“Plan”表示物镜类别;图3.18(a)“1.25”后的“OIL”表示物镜的浸润介质为油浸,图3.18(b)和图3.18(c)中的物镜没有标记类似字母表示物镜是介质为空气的干系物镜。第二行“/”前的“160”表示物镜所适用的显微镜机械筒长为160 mm;“/”后的“0.17”表示物镜所要求的盖玻片厚度为0.17 mm。图3.18(d)中“∞”表示无限远筒长(物镜成像于无穷远处),“0”表示该物镜不需要盖玻片,“WD17.8”表示物镜工作距离(是指当所观察的样品最清楚时物镜的前端透镜下面到标本的盖玻片上面的距离)为17.8 mm。

图3.18　物镜及标刻在上面的各种性能标记

盖玻片是薄且平的透明玻璃片,通常为方形或矩形,宽约20 mm(4/5英寸),国际上规定,盖玻片的标准厚度为(0.17±0.01)mm,放置在用显微镜观察的物体上。物体通常放置在盖玻片和较厚的显微镜载玻片之间,盖玻片的主要功能是保持固体样品平压,液体样品成形为均匀厚度的平坦层;还可以避免液体和物镜相接触,以免污染物镜,并且可以使被观察的样品最上方处于同一平面,即距离物镜距离相同,观察到的图像更清晰。

(2)物镜的分类

①按照物镜前透镜与盖玻片之间的介质分类。

物镜可以分为干燥系物镜和浸液系物镜两类。干燥系物镜是指物镜前透镜与盖玻片之间以空气(n=1)为介质,这类物镜最为常用,物镜的放大倍数一般在40倍以下,数值孔径均小于1。浸液系物镜是指物镜前透镜与盖玻片之间以液体(n>1)为介质,这里的液体一般为水或油,若为水(蒸馏水或生理盐水)则称为水浸系物镜,一般有“W”标志,主要应用于生理学检测(如脑片等较厚样品的观察);若为油(香柏油、无荧光油、甘油或液状石蜡)则称为油浸系物镜,一般有“OIL”(或“HL”“油”“Y”)标志,数值孔径均大于1。

②按照像差校正程度分类。

物镜可以分为消色差物镜、复消色差物镜、半复消色差物镜、平场物镜、平场消色差物镜以及平场复消色差物镜。

消色差物镜(achromatic objective),这种物镜是用于一般观察的、最普通类型的物镜,在物镜的外壳上一般标有“ACH”字样或不标注字母,这类物镜仅能校正轴上点红蓝光的色差和黄绿光的球差,以及消除近轴点的彗形像差。但不能校正其他光的色差和球差,且场曲率很大。

复消色差物镜(apochromatic objective),通常采用特种玻璃或萤石等材料制作而成,物镜的外壳上一般标有“APO”字样,这类物镜不仅能校正红绿蓝三色光的色差,同时能校正红蓝二色光的球差,适用于高级研究镜检和显微照相。

半复消色差物镜(semi apochromatic objective),又称氟石物镜、荧光物镜,物镜的外壳上一般标有“FL”字样,是由一种光学性能不同于玻璃的矿物质——萤石(CaF2)所制成。这类物镜在结构上透镜的数目比消色差物镜多、比复消色长物镜少,能校正红蓝二色光的色差和球差,可用于荧光观察。

平场物镜(plan objective),物镜的外壳上一般标有“PLAN”字样,这类物镜在透镜系统中增加了一块半月形的厚透镜,以达到校正场曲率的目的,平场物镜的视场平坦,适用于镜检和显微照相。

平场消色差物镜(plan achromatic objective),物镜的外壳上一般标有“A-PLAN”字样,这类物镜是在红蓝色差校正的基础上,对场曲率做了进一步校正,因此图像平直,使视野边缘与中心能同时清晰成像。

平场复消色差物镜(plan apochromatic objective),这类物镜除进一步对场曲率做了校正外,其他像差校正程度与复消色物镜相同,可使图像清晰、平坦,进一步提高成像质量。

另外,还有平场半复消色差物镜、超平场物镜(外壳标有“S PLAN”)、超平场复消色差物镜(外壳标有“S PLAN APO”)、消像散物镜等。

③按功能分类。

物镜可以分为相差物镜、DIC物镜、HMC物镜、偏光物镜以及多功能物镜。相差物镜(phase contrast)一般带有PH标志,且字体用绿色,在倒置显微镜上使用广泛。DIC物镜是指微分干涉差显微镜(differential interference contrast microscope)可用的物镜,一般要求是半复消色差物镜。HMC物镜是指霍夫曼调制相衬系统(hoffman modulation contrast)可用的物镜,带有HMC标志,是一种类似相差物镜的物镜,观察效果立体感较强,但不能用于荧光观察。偏光物镜是指偏光显微镜(polarizing microscope)用物镜,一般带有POL字样,这种物镜装配了克服应力设备,是专做偏光的物镜。多功能物镜一般带有U标志,可以同时做相差、DIC、荧光等,比如奥林巴斯的UPLFLN(万能平场半复消色差)物镜和蔡司的EC PLAN-NEOFLUAR(高荧光通透性物镜)系列物镜。

④特殊物镜。

特殊物镜有带校正环物镜、带虹彩光阑的物镜、无罩物镜、反射物镜、用于不可见光的物镜以及显微照相物镜等。(www.zuozong.com)

带校正环物镜(correction collar objective),物镜中部装有环状的调节环,当转动调节环时,可调节物镜内透镜组之间的距离,从而校正由盖玻片厚度不标准引起的覆盖差。如物镜外壳的调节环上标有数字“11～23”,表明可校正盖玻片厚度为0.11～0.23 mm的误差。

带虹彩光阑的物镜(iris diaphragm objective),物镜镜筒内的上部装有虹彩光阑,外方也有可旋转的调节环,转动时可调节光阑孔径的大小。这种结构的物镜是高级的油浸物镜,常用于暗视野观察。在暗视野镜检时,往往由于某些原因而使照明光线进入物镜,使视场背景不够黑暗,造成镜检质量的下降。这时调节光阑孔径的大小,使背景变黑、被检物体更明亮,增强镜检效果。

无罩物镜(no cover objective),有些被检物体,如涂抹制片等,上面不能加用盖玻片,在镜检时应使用无罩物镜,否则图像质量将明显下降,特别是在高倍镜检时更为明显。这种物镜的外壳上常标刻“NC”,同时在标记盖玻片厚度的位置上标刻着“0”。

反射物镜,又可称为反光物镜,是一种利用反射现象成像的物镜,是根据球面反光镜成像时不会产生色差的原理制造的,但是单色球面差和场曲率等缺陷仍然存在,且这种物镜的放大倍数一般较低,因此它的使用范围很有限。

用于不可见光的物镜,是指用于不可见光显微镜(紫外光显微镜和红外光显微镜)中所用物镜,一般是用石英或其他能透过不可见光的材料制造的。

显微照相物镜,这种物镜对于场曲率有较高的校正程度,在专门设计用于曝光的镜台上使用,可以用低放大倍数拍摄一个很大的物场,例如使用放大倍数为1的平面显微照相物镜时,可以拍摄物场直径达1 cm的显微照片。

2)目镜

目镜的作用是将物镜所形成的中间像进一步放大,使之便于观察,但它并不能提高显微镜的分辨力。有的目镜还可以校正物镜未能完全校正的像差。

目镜的基本结构是两个或两组透镜,这两个或两组透镜分别装在目镜筒的上部和下部,上面的即靠近眼睛的透镜称为前透镜(或目透镜),下面的透镜称为场透镜。另外在金属目镜管内还有一个决定最终视场大小的环状光阑,它正处于中间像的平面上。这样中间像平面在镜筒中的位置是固定的,而物镜和目镜的物距和像距各自可以进行调节。

目镜中的场透镜对目镜的放大并不起重要作用,实际上还稍稍缩小了中间像的大小,它能将视野边缘部分的光线向中央集中,使得不能达到眼睛的斜射光可以参与像的形成,并且增加了像的亮度。由于场透镜处在离中间像不远的地方或就在中间像平面上,这就适当地增大了目镜的视场,而且可以把中间像带入与目镜透镜相关的任何所要求的位置。另外,场透镜还可以与前透镜配合,进一步校正物镜的像差和色差,并能校正物镜所造成的扩大畸变。

(1)目镜的分类

根据构造,目镜可以分为惠更斯(Huygoens)目镜、拉姆斯登(Ramsden)目镜、补偿目镜以及广视场目镜。

图3.19　惠更斯目镜的剖面图

①惠更斯目镜。

图3.19所示为惠更斯目镜的剖面图,惠更斯目镜是由两片未经过色差校正的平凸透镜(凸面向下)组成:靠近眼睛的一片称为目透镜,起放大作用;另一片称为场透镜,它的作用使像亮度均匀。在两块透镜之间的目透镜焦平面放一光阑,把显微刻度尺放在此光阑上,就能从目镜中观察到叠加在物像上的刻度。

惠更斯目镜既可用于观察,又可用于照相。当物镜所成的像在目透镜焦点之内时成放大虚像,可进行显微观察;当物镜所成的像在目透镜焦点之外时成放大的实像,可进行显微摄影。惠更斯目镜因焦点在两片透镜之间,故不能单独作为放大镜使用。这种不能单独作放大镜用的目镜叫作负型(或阴型)目镜。惠更斯目镜没有校正像差,只适合与低、中倍消色差物镜配合使用,它的放大倍数一般不超过15倍。惠更斯目镜结构简单,价格便宜,最为常用。

②拉姆斯登目镜。

拉姆斯登目镜的前透镜和场透镜是两块凸面相对的平凸透镜,两者的焦点相同,中间像平面落在场透镜之外,可以看作单一的凸透镜,并能单独作为放大镜使用。这种可以单独当作放大镜使用的目镜称为正型(或阳型)目镜。拉姆斯登目镜对像域弯曲和畸变有较好的校正。在同样的放大倍数下,其视场比惠更斯目镜小。

③补偿目镜。

补偿目镜使用透镜组合来代替单个透镜,有意使目镜出现一种与物镜相反的像差和色差,以便使彼此正好抵消。补偿目镜是一种特制的可校正垂轴像差的目镜,分负型和正型两种,配合N.A.>0.65的消色差物镜、所有的复消色差物镜及平场消色差物镜使用,可以消除后者校正不足的垂轴色差,使得边沿也能得到清楚的映象,可用于高倍观察。补偿目镜端面标有“K”字样和放大倍数。

④广视场目镜。

广视场目镜又称为平场目镜或广角目镜,是一种具有较大视场的目镜,视场的直径可达23.2 mm。它配合平场物镜使用,可以扩大初次放大实像的有用面积,图3.20示出一种广视场目镜的剖面图。

图3.20　一种广视场目镜的剖面图

(2)目镜的眼点

如果在目镜的上面放置一块荧光透明物质或场玻璃,就可以看到从显微镜目镜中射出的光束呈陀螺形。在目镜上面所出现的光线交叉点被称为眼点,有时也称为出瞳。眼点的横切面呈圆盘状,在光学上眼点是显微镜所形成的物镜孔径的像,其直径(通常为1～1.5 mm)与物镜的有效数值孔径成正比,与显微镜的总放大倍数成反比。由于眼点是眼睛的瞳孔为了接受来自目镜光束的所有光线所处的位置,因此眼点的高度在实践中非常重要。一般类型的目镜在10 mm左右,但是这对于戴眼镜的观察者来说是不够的,因此已经设计出了一种具有超高眼点的特殊目镜,称为高眼点目镜(眼点高度可达16 mm),在这种目镜上标有“眼镜”图样。

(3)目镜和物镜的有效组合

要分辨一个物体的结构(如两个点)只使用一个具有合适数值孔径的物镜是不够的,这两个点的像对于眼睛必须提供一个足够大的角度,在具有良好照明和反差的情况下,这个角度必须大于2′弧,大约相当于相距0.15 mm的两个点,这个限定的角是建立在视网膜上视觉感觉细胞的大小和排列距离的基础上,为此物镜和目镜的总放大倍数必须保持在250×N.A.的水平上。当两个可分辨的点在4′弧的角度下被观察时,就可以达到分辨的最佳调节,这时的总放大倍数为500×N.A.。当物镜和目镜的总放大倍数超过1 000×N.A.时,由于透镜的像差和色差会使得已经形成的像变得越来越模糊,这个现象称为空放大。因此,物镜和目镜的总放大倍数在500×N.A.～1 000×N.A.范围内时被称为有效放大倍数。

另外,对于一定放大倍数下物镜和目镜组合的选择还应考虑场深的影响,场深是指在显微镜中形成一个清晰像的物体层厚度。场深在显微镜中是十分重要的,场深不宜太小。