激光技术在细胞工程中的应用

实施激光细胞融合、激光细胞外源基因导入、激光“改造”细胞内部组成需要一些技术支撑，主要有激光光镊技术和激光微束技术。

（一）激光光镊技术

激光光镊是利用激光阱在空间上准确定位以及操作移动细胞的新型技术，在对细胞操作过程中不产生机械损伤、不干扰细胞周围环境且可以遥控操作。在生物学和医学领域，利用激光光镊能够进行分选细胞，或者使两个或多个细胞相互紧密接触，或捕获单个活细胞，甚至在细胞内操纵细胞器，进行外源注入细胞、细胞内染色体切割与分选等精细操作，这是细胞工程、农作物改良育种等领域的重要技术。

1．激光梯度力

激光梯度力是激光镊的技术基础。照射物体的激光束的光强度空间分布如果不是均匀的，比如单横模激光束，它的强度空间分布形式是高斯分布，在与激光束传播方向垂直的截面上，其光强度随着远离光束中心逐渐减弱。又比如激光束经过凸透镜后发生汇聚，它的光强度将随着离开透镜而逐渐增强，在焦点的强度达到最高，在离开焦点后又逐渐减弱。那么在这种光强度空间分布不均匀的激光束作用下，物体受到的光束作用力将是不均匀的，在光束强度高的地方，产生的作用力大，这种由光束强度梯度分布产生的作用力称“梯度力”，力的方向指向光强高的方向。这意味着，激光束照射到物体上时除了对物体施加推力之外，也会给物体施加拉力。一束经过透镜汇聚的高斯激光束照射放置于液体的光学透明小球，激光束在通过小球时会发生折射，在这个过程中激光束与小球之间会发生动量交换。因为经透镜汇聚的高斯激光束在垂直于激光传播方向以及激光传播方向都有梯度光电场，在这种情况下小球将受到两种梯度力作用，一种是横向梯度力，作用力方向垂直于激光传播方向并且指向光轴，其作用是把小球拉往靠拢激光束的光轴；另外一种是纵向梯度力，作用力的方向沿着激光束的传播方向，并且是把小球拉往激光汇聚的焦点方向运动。这就是说，在激光场中的小球受到了横向和纵向的束缚力，其结果是不让它离开激光焦点位置。激光束被透镜汇聚得越厉害，即激光场梯度越大，束缚小球的激光力也就越大。当然，激光束的光强度高，其束缚力也大。

如图4-14所示，假定介质小球的折射率为n1，它周围介质的折射率为n0，这介质小球的球心处于激光束焦点下方。此时当透镜光轴外的光线a，b进入介质小球上时被小球折射，激光束折射后的传播方向趋向靠拢透镜光轴，即激光束增大了小球纵向运动的动量。由动量守恒定理，小球相应地获得了反方向的动量，相应地受到反方向的作用力，即图中光线a，b施加在小球上的力Fa，Fb，其合力沿负激光光轴方向。所有照射到小球上的光线被其折射后都贡献一份沿光轴反方向的作用力，它们的合力都趋向于把小球拉向透镜焦点。小球表面反射激光时也传给小球动量，但此动量变化很小。此外，产生沿激光束传播方向的散射力也很小。

图4-14　单激光束梯度力

对于球心处在激光束焦点上方、焦点右方的小球，由类似的力学分析可以得到，激光通过小球发生折射后，小球将分别受到指向正光轴方向和朝左方向的梯度力，它们是使小球趋向于透镜焦点运动。这样一来，通过透镜的高斯激光束将给被照射的小球施加朝各方向的作用力，都是试图把小球束缚在透镜焦点上。

2．激光光阱

基于激光梯度力可以构成激光阱，落入该阱内的微粒子将被囚禁。粒子在光强空间非均匀分布的光束中将受到梯度作用力，它驱赶粒子往光强的方向移动。粒子同时也受到散射力作用，驱赶它往光束传播方向移动。这样一来，光强空间分布适当的激光光束，将让粒子所受到的梯度力方向与受到的散射力方向相反，而作用力的大小又几乎是一样，那么在这样布局的激光束中某个位置上，粒子受到的作用力将达到平衡，它将被“俘获”在这个位置上。或者说，这样的激光光束构造了一个势阱，能够囚禁粒子，把粒子固定在这个位置上。而当这样的势阱移动时粒子也被带着移动，如图4-15所示。这样的激光光阱可构造激光镊子。

图4-15　激光阱囚禁微粒和移动微粒示意图

3．激光镊组成

图4-16是激光镊子结构组成示意图，主要由两部分组成：微粒捕获系统和成像系统。

图4-16　激光镊结构组成示意图

1）捕获粒子系统

捕获系统由激光器、空间滤波器、准直透镜、偏振变换器、衰减片、扩束系统、二向色性分束镜、显微物镜、容器及三维微位移平台和控制箱等组成，它的主要功能是产生高度聚焦的激光束，并利用该激光束构成的激光阱实现对粒子的捕获和操控。其基本工作过程是：从激光器发出的激光束首先经过显微物镜和针孔组成的针孔滤波器，进行空间低通滤波以消除杂散光。然后，经过准直透镜转变为平行激光光束，它再经过一个偏振变换器进行光的偏振态转化，比如利用液晶偏振转换器，将把线偏振光转换为径向偏振光或切向偏振光。然后利用随后的光学衰减片和光学扩束系统，调制该激光束的功率大小及光斑大小。经过这样调整处理的激光束然后被二向色性分束镜反射，并入射到水浸物镜，对激光光束实施会聚，在物镜焦平面附近形成一个尺寸微小的聚焦光斑，该聚焦光斑将可以对其附近的粒子产生力的作用，实现对粒子捕获及某些独特操控。

（1）激光器和激光束。通常采用的是连续输出激光器，其输出的激光功率为几十毫瓦至几瓦。为了防止在激光阱内的微粒受到光学吸收作用而引起损伤，一般选用的激光波长是微粒吸收系数很小的波长，即采用输出激光波长在700～1 300 nm范围内的激光器。

采用的光强度空间分布形式一般是高斯光束或者贝塞尔光束或者拉盖尔-高斯（LG）模式光束。

高斯激光光束是构造激光阱的基本激光光束形式。根据高斯激光光束的传输特点，光束离开焦点瑞利长度后会出现显著发散，因此采用高斯光束构造激光阱的光镊，它只适宜在激光光束的焦点附近（距微粒数微米）操控微粒，否则会无法有效地进行操控微粒。采用由贝塞尔激光光束形成的激光阱，可以克服高斯激光阱这种局限性。

贝塞尔激光光束的截面光强分布包括一个中心亮斑和一组同心亮环，光束传输若干个瑞利长度后也没有出现明显的发散。图4-17是贝塞尔激光光束的横向光场分布，零阶贝塞尔激光光束的中心是一个亮斑，这里聚集了光束的大部分能量，可以用来捕获折射率大于周围液体的透明微粒。高阶贝塞尔激光光束的中心是一个暗斑，随着阶数增加暗斑半径也随之增加，这个暗斑可以看作是一个光学陷阱，对折射率小于周围液体的光学透明微粒或非光学透明的吸收型微粒，在这个陷阱中会受到指向暗斑中心的梯度力，从而被囚禁在暗斑中心。另外，如果贝塞尔光束中心被微粒遮挡，光束传输了一定距离后会重新恢复原来的形状，不受微粒遮挡的影响。贝塞尔光束的这些特点可以被用来构造柱形光阱，在纵向上可以有多个微粒被同时捕获在光阱中，图4-18是单激光束光镊和贝塞尔激光光束光镊捕获微粒的情况示意图。普通单激光光束构造的光镊只能在光束的焦点处捕获一个微粒，而使用贝塞尔激光光束构造的光镊，它则可以在激光光束传播方向同时捕获多个微粒。

图4-17　不同阶贝塞尔激光光束的光场空间分布

图4-18　单激光束光镊和贝塞尔激光光镊捕获微粒示意图

随着微粒半径的减小，光镊的捕获力也会快速地减小。捕获微粒所受到的干扰因素也多，其中最难以克服的就是布朗运动。在米氏散射粒径范围内的粒子，可以不考虑其布朗运动的影响，但是在微粒半径远小于光波长情况时就必须考虑其影响。采用基模高斯激光光束的光镊，可以通过减小其束腰半径，以求获得阱深度较深的激光阱，但利用激光器输出的激光束比较难达到这个要求。不过，采用多光束干涉产生的光场在一定程度上可以获得阱深度较深的激光阱，但所用的光路结构会比较复杂。利用贝塞尔激光光束构造的光阱可以比较有效地克服布朗运动对粒子捕获的影响。

通常是使用轴棱锥镜将高斯光束转换成贝塞尔光束，经准直的高斯光束入射到轴棱锥镜底面上，在轴棱锥镜后可以得到近似零阶贝塞尔光束。另外，贝塞尔光束具有轨道角动量，可以与其他模式激光束（例如高斯光束）干涉形成特殊的光场模式，用于构造光致微粒旋转的激光阱。贝塞尔光束光镊主要缺点是轴向光梯度力很小，要产生足够的光梯度力需要加大激光器输出的功率。

拉盖尔-高斯激光光束具有圆形截面，强度空间分布为环形，光束中心强度为零，这可以大大降低对光捕获微粒起阻碍作用的散射力，从而提高激光阱的捕获效率、降低捕获粒子所需要的激光功率。此外，由这种光束构造的激光阱还可以实施旋转微粒的操作，因为这种光束具有螺旋形的波阵面，每个光子都具有轨道角动量。在光束传输过程中，由于光子轨道角动量传递给了被捕获的微粒而产生转矩，使微粒发生旋转运动。

产生拉盖尔-高斯光束的方法主要有在共振腔内加入细丝法、使用柱面镜系统变换光束法、使用螺旋相位片生成法、计算全息再现法和衍射光栅法等。

（2）光束扩束系统。由透镜组和空间滤波器组成。光束扩束是为了能够有效地使激光光束充满显微物镜，以便得到高度会聚的激光光束，提高光阱梯度力。空间滤波器的作用是截取激光束的有效半径，提高光束质量，以得到更均匀的单模高斯光束。

（3）位移平台控制箱。在实验研究过程中，经常需要精确地移动和控制微粒位置，特别是在双激光镊操作系统中，不仅需要对每个激光阱的位置进行精确而灵活的操纵，同时还需精确、定量地控制和改变两个激光阱间的相对距离。而对激光阱中心位置进行有效而精确的操纵，也是定量测定对微粒作用力和微小位移的前提。

对微粒的操控可分横向（X-Y方向）控制（见图4-19）和纵向（Z方向）控制（见图4-20），横向控制是固定激光光束，被捕获在激光阱中心的微粒不动，操控载物台上的压电陶瓷驱动样品池进行三维移动，激光阱中心对样品做相对移动，图4-19中箭头表示背景微粒的运动方向。

图4-19　横向（X-Y）操控微粒

图4-20　在纵向（Z）控制微粒

纵向操控是通过调节物镜与样品台的相对位置实施对微粒操控，即通过移动激光阱中心位置，改变激光阱对微粒的作用力进行操控。图4-20左图中左侧一微粒已被激光阱捕获，微调显微镜的物镜，改变激光阱中心的纵向位置，此时被捕获的微粒将随物镜的移动而移动，因为它仍然保持良好的成像条件，所以依然能够获得清晰的图像；在右图中，微粒不在激光阱中心，没有受到激光阱的控制，因此它不随物镜一起移动，偏离了成像平面，所以它们的图像逐渐变得模糊不清。

控制位移系统包括电子驱动系统、计算机控制系统，前者主要是反馈放大电路，后者包括光标引导的激光镊与样品池的相对移动和位置记录、激光束移动的位置记录和坐标换算等。

（4）显微物镜。它既作为显微成像物镜，又对光束进行会聚，产生大的梯度力，构成光阱。对显微物镜的要求主要是其数值孔径NA要大（大于1．2），以满足梯度力大于散射力的光阱形成条件。另外，还需要对显微镜做适当的改造，将光镊和探测光路耦合进显微物镜系统。在光镊系统中使用的显微物镜一般选用油浸物镜，因为它具有较高的数值孔径，即出射光线的汇聚程度增大，得到光梯度力随之增强。但在实际应用中，特别是生物学应用中，被捕获和操控的微粒通常处于水溶液环境，在这样的条件下使用油浸物镜，光线从物镜出射后，经由油和玻璃进入水中形成光阱。油和玻璃的折射率相近，但与水的折射率差别较大，光线经过玻璃和水的界面将产生明显的折射，从而产生明显的球差。球差会严重降低光阱的纵向捕获效果。从几何光学知道，球差将导致部分光线无法进入被捕获的微粒，即透镜的数值孔径没有被完全利用。光阱的纵向捕获效果与会聚透镜的数值孔径值大小密切相关，当数值孔径值变小时，光束会聚程度将减小，光束所产生的梯度力减小，相应获得的光阱的捕获效率也就降低。由此可以定性得出，折射率不匹配造成的球差将导致光阱的捕获效率降低。其次，还需要考虑物镜的光学质量，如果光学设计不理想和制作工艺不精良，导致显微物镜存在像散，这也将影响轴向和横向光阱力，会出现梯度力无法克服散射力将微粒拉回光阱中心，甚至发生在光阱中心处不但无法囚禁微粒，反而将其推出光阱中心的情况。这就导致光镊工作性能下降，影响了光镊对微粒的捕捉、操控。

也可以使用光纤透镜进行光束会聚。把光纤出射端面做成一个微米尺度的半球形微透镜，激光经光纤微透镜聚焦形成梯度力，并构造可以捕获微粒的光阱。这种光阱的稳定性还得到提高，从而有可能捕获较大体积的微粒。此外，采用光纤微透镜聚焦的光阱还可以与光谱仪结合起来使用，以获得捕获微粒的光谱信息。

2）成像系统

它的主要功能是对捕获的微粒进行成像并进行特征信息分析，如微粒的位置、位移量、微粒数量及形状等信息。它主要由照明光源、聚焦透镜、显微物镜、二向色性分束镜、CCD相机及计算机等组成。其基本工作原理是：照明光源产生照明光束照射被捕获的微粒，产生的散射光束携带着微粒的信息。该散射光束经过水浸物镜、二向色性分束镜和CCD成像透镜后成像到CCD相机接收面上，CCD采集的图像被进一步输入到计算机中，在计算机中可显示微粒的图像，经过图像处理还可提供微粒的特性信息，包括粒子数量、形状、位置以及位移等。为更好地实现成像，在CCD相机前可以使用可调焦镜。在进行微粒成像时可先通过手动调控可调焦镜头实现初步对焦，然后再利用计算机控制三维平移台沿Z方向微小移动实现精确对焦。另外，也可以通过计算机控制三维平移台在X-Y平面内移动，实现微粒的动态操控。(www.zuozong.com)

4．几种典型光镊

激光镊出现后，它的种种优越性能立即吸引了科学家和工程师们的注意力，纷纷投入到这个领域研究和开发，光镊技术获得快速发展，已经由最先的单激光光束光镊发展了多种激光光束光镊。

1）全息激光镊

它是利用全息元件构建的、具有特定光场分布形成激光阱的光镊。把利用计算机产生的全息图加载到空间光调制器上，激光束经扩束准直后照射到空间光调制器上，衍射光被调制成所需要的光强空间分布，然后再通过一个望远镜系统将光束收集起来进入显微物镜，在显微物镜的焦平面上形成所需要的光点阵列，其中每一个光点都可以作为一个光阱。通过编程改变全息图，相应地改变光点阵列结构，便可以同时捕获和操作多个微粒。

全息光镊技术极大地扩展了单光束的激光镊应用范围，原则上可以产生任意形状、任意大小和任意数量的光阱，目前已经可以获得数量多达400个光阱的全息阵列光镊。结合计算机全息技术，还可以对其中单个光阱的特性进行动态改变，这样产生的实时光阱可以对运动的、高分散的微粒进行捕获，并同时操作多个微粒。

2）光纤光镊

基于利用显微物镜形成激光梯度力构建光阱的激光镊，通常其体积都比较大，移动样品的自由度比较小，很难操纵位于狭窄位置的微粒，比如位于深孔中的微粒。利用两根精确准直相向传播的单模光纤平端面出射的激光束可以形成光阱构造激光镊，即光纤激光镊，它的最大特点就是由光纤形成的光阱及其操纵是与光学显微物镜分离的，此时使用的光学显微物镜只起观测功能，这就使观察和操纵样品能够有更大的自由度，并且可以办到其他非光纤光镊比较难做到的事，比如对样品的光学吸收、光阱弹性等的测量。不过，目前这种激光镊的轴向捕获效率还较低、操纵精度还不高。

利用光纤末端面精磨成逐渐变细的半球面状，从其末端面出射会聚的激光束也能够形成光阱。由这种自透镜单模双光纤光阱构造的光镊其稳定性比较好，而且提高了光镊捕获区域范围。把一个半球面自透镜光纤按一定角度插入样品室形成光阱，就可实现对微粒和生物细胞进行激光束操控。一根自透镜单模光纤形成的光阱只能对沉于样品池底壁上的微粒实现光操控，不能克服微粒的重力实现光悬浮，即不能把微粒从样品池底壁提升于溶液中的任何位置；但如果把两根自透镜单模光纤成一定光轴夹角放置，由交叠光场形成光阱，那么当两根这种光纤同步垂直向上移动时，被捕获的微粒便可以克服微粒的重力作用，实现微粒的光悬浮，让它们始终悬浮在合成光束的焦点位置上。

3）飞秒激光光镊

飞秒激光是脉冲持续时间为飞秒量级的短脉冲激光，相对于脉冲持续时间为纳秒或皮秒脉冲激光，很小单脉冲能量便有很高的峰值功率，因此飞秒激光作用于生物组织时几乎不对周围组织产生热损伤，因而具有极高的空间分辨率。同时，生物学过程中存在的一些超快过程，利用飞秒激光能够研究它们的瞬态现象，可以获得极高的时间分辨率。为适应生物学研究领域的需要，人们开发了飞秒激光光镊。

与使用连续波激光和长脉冲激光的激光镊不同，在使用飞秒脉冲激光时，作用于被捕获微粒上的光学梯度力是短脉冲式的，即只有在飞秒激光脉冲持续时间内，微粒才受到光学梯度力束缚，微粒在相继两个光脉冲之间不受激光梯度力作用，但它们依然受到布朗运动惯性力和重力作用，有逃逸出光镊捕获区的趋势。因此，飞秒激光光镊能否实现对微粒稳定捕获，关键在于下一个飞秒激光脉冲产生的激光捕获力能否将偏移了捕获中心（即偏离激光镊的光阱中心）的微粒再拉回到捕获中心。微粒任何偏离光轴的横向位移都将受到光阱产生的恢复力作用，它有可能抵消由于布朗运动和重力造成的偏移，使微粒被稳定地捕获在光阱中心附近。

（二）激光微束技术

这是利用光学系统会聚激光束，在目标上获得直径与光波长相当的激光微束。采用激光微束技术可以有选择地进行切割染色体、操作有丝分裂细胞等工作，以便研究细胞器的功能、结构以及进行细胞融合、外源基因导入、细胞内部加工改造等。

1．激光微束系统组成

激光微束系统主要由激光器、显微镜系统和监控系统3部分组成。

1）激光器

根据不同需要选择不同输出特性的激光器。由于各种不同生物、细胞以及同一细胞内部各个部位、各组成部分，它们对某一波长激光的吸收系数和散射系数均不相同，所以激光与它们相互作用状况也就不相同。对某种细胞或细胞内的某一部位、某一组分，存在着相应的“最佳作用波长”，即当利用该波长的激光束照射细胞的这一部位或组分时，发生的作用效果最显著，这就要求激光微束系统使用的激光器的输出波长可调谐。同样，各种生物细胞承受激光照射的剂量有限，一旦激光能量密度超过某一临界值细胞就会损伤、死亡。各种生物细胞以及同一细胞的各部位、各组分所能承受的极限激光能量密度也均不相同，这就要求激光微束系统的激光器输出能量可调。此外，为了将激光微束照射所造成的损伤严格局限在预定的照射部位，使被照射部位以外的区域没有受到明显影响，这不但需要对激光微束的能量密度、光束直径进行严格的控制，还要求激光微束的作用时间尽可能短；或者说激光微束系统的激光器是脉冲输出，并且其激光脉冲宽度应尽可能窄，或者说使用的激光器应该是超短脉冲激光器。

2）显微镜

它是用来将激光聚焦成直径微米量级激光光束的光学系统，对使用的显微镜有几方面的要求：①用于贴壁细胞激光微束照射的显微镜，可以是倒置的，也可以是直立的，但非贴壁细胞由于重力的作用，细胞都沉在底部，使用的显微镜必须是倒置的；②显微镜中应有一个低倍物镜用于寻找细胞；③显微镜中必须有一个比较合适的通道，方便把激光束从中引入显微镜内，由物镜对其聚焦；④显微镜是相差式的，以便能够观察未经染色的活细胞；⑤显微镜的物镜能透过使用波长的激光。

由于聚焦光斑直径和聚焦物镜的焦距成正比，要聚焦的光斑直径小，就必须使用短焦距聚焦物镜，而一般显微镜聚焦物镜在焦距为6．25 mm时（相当于40倍物镜），其工作距离便已短到小于0．5 mm，这样短的工作距离将使得照射观测生物样品十分困难。使用双反射式聚焦物镜可以克服这个困难，其数值孔径NA≈0．35、焦距6．25 mm双反射式聚焦物镜，工作距离可大于15 mm。

3）监控系统

主要由摄像机、照相机、监视器等组成，主要用来实现连续观察和动态记录。

2．激光微束给细胞穿微孔

进行激光细胞融合以及激光细胞外源基因导入，都需要对单个细胞用激光在细胞膜上的特定位置产生单个瞬时微小孔。

图4-21是激光微束在细胞上穿孔的示意图。激光束通过高倍率物镜（数值孔径≥0．8）聚焦于焦平面，产生光斑尺寸接近光学衍射极限（≈1μm）的激光束，其光斑尺寸远小于细胞尺寸（约10μm）。通过调控焦斑处的激光脉冲能量、重复频率等，能够对细胞膜、细胞器进行微操控穿孔手术。

图4-21　激光微束在细胞上穿孔

1）激光穿微孔类型

目前，激光穿孔技术按照其可能的物理机制大致可分为5类：连续激光穿孔，纳秒、皮秒激光脉冲穿孔和经放大的千赫兹飞秒脉冲激光穿孔，飞秒激光振荡器发出的兆赫兹脉冲序列激光穿孔，双脉冲射流激光穿孔和嗅鞘细胞突起切割生成微孔等。

（1）连续激光穿孔。这是基于细胞膜的线性光学吸收改变膜通透性实现穿孔，使用的是连续输出激光器，如染料激光器、氩离子激光器、半导体激光器等。

（2）纳秒、皮秒激光脉冲和经放大的千赫兹飞秒脉冲激光穿孔。这是基于光致击穿现象所引起的机械效应在细胞膜表面“凿出”一个小孔。使用的是纳秒、皮秒或者经放大的数个飞秒激光脉冲序列，其激光脉冲强度很高，通常使用的激光器是脉冲输出Nd∶YAG激光器（脉冲宽度脉从0．5～17 ns）、准分子激光器、氮分子激光器等。

（3）飞秒激光振荡器发出的兆赫兹脉冲序列激光穿孔。使用的是飞秒激光振荡器输出的兆赫兹脉冲序列，其激光强度非常高，达到1012W／cm2数量级，而且其脉冲宽度小于细胞膜热弛豫时间，在空化气泡形成之前能够形成一个可调的低密度等离子区域，很多激光辅助细胞微手术是基于此种可调低密度等离子体实施的。通常使用的激光器主要是钛宝石激光器，其输出激光中心波长一般为800 nm，脉冲重复频率在80 MHz左右，脉冲宽度为10～200 fs。

（4）双脉冲射流激光穿孔。采用脉宽为纳秒量级、激光波长不同的脉冲激光，经一个高倍率物镜聚焦在目标上实施穿孔，图4-22是穿孔工作原理。使用的这两束激光焦点间距离可调，两束激光脉冲时间间隔由数字延时发生器控制。在激光穿孔中通常需要避免激光能量超过光致击穿阈值，否则会产生大的空化气泡（直径＞10μm），这种气泡膨胀或坍缩时引起的剧烈机械效应很容易撕裂细胞，利用空化气泡坍缩时产生的微射流可以避免出现撕裂细胞。当第一个空化气泡B1由较小的尺寸膨胀到较大尺寸时，第二个空化气泡B2恰好产生，此时这两个空化气泡是反相位耦合的结果，B1的坍缩伴随着B2的膨胀，导致空化气泡非对称的变形并形成由B2指向B1的微射流。随后B2开始坍缩，其与B1接触的尖端势能最大，收缩最快，形成了由B1指向B2的第二个微射流，微射流最高的速度可达到10 m／s，利用此微射流可以对细胞膜进行穿孔。

图4-22　双脉冲射流激光穿孔工作原理

（5）嗅鞘细胞突起切割生成微孔。飞秒激光功率产生的冲击波具有很高压力，可以非常容易地使细胞膜突起而被断裂。激光对嗅鞘细胞突起进行切割的过程中会伴随着微管的解聚、突起的收缩，但是由于细胞膜的自愈合使细胞恢复了活性，没有导致细胞死亡。因此，激光对细胞突起的切割可以在细胞膜上创造可修复的微孔。

2）影响微孔直径因素

影响在细胞的穿孔直径主要有两个因素：一个是光学系统聚焦的激光束光斑直径，另外一个是激光微束的能量密度。研究显示，对激光微束的能量密度控制很重要，如果激光微束的能量密度能较好地控制在细胞损伤（或穿孔）的临界值附近，由于激光脉冲与细胞相互作用的持续时间短，在细胞指定照射部位之外的区域没有明显的热传导现象，即激光微束照射的热效应影响将受到局限，于是穿孔直径情况将是细胞穿孔直径≤细胞损伤点直径≤激光微束束腰直径；如果激光微束的能量密度超过细胞损伤（或穿孔）临界值，即使聚焦光斑直径很小，对准细胞的中心部位照射时仍可能使细胞受到较大范围的损伤。因此，使用飞秒激光进行穿孔有独特的优越性，能够在细胞膜上产生单个、特定位置的和瞬时的穿孔，并保持细胞的完整性。