激光细胞融合的影响因素及操作技巧

细胞融合也称细胞杂交、原生质体融合，是把两种不同生物体的细胞“融合”到一起，组成一个新细胞，在这个新细胞里面因为包含了原先两种生物体的遗传物质，由这个细胞发育生长将培育成为新的物种、品系，它兼有两种生物体的品性。这种培育新生物品种技术克服了传统杂交技术的局限性，也打破了物种之间互不来往的界限，而且不仅可以在植物之间、微生物之间进行远缘杂交，甚至可以在动物与植物、微生物之间杂交，这将创造出种类更多、品质更丰富的新生物品种，更好地满足人类在医药、食物、生活各方面的需要。

实施细胞融合的方法有多种，如灭活病毒诱导细胞融合法、聚乙二醇（PEG）诱导细胞融合法、电场诱导细胞融合法，激光细胞融合法等，下面主要介绍后者。

激光细胞融合法的主要优点是：①能对任意两个细胞，包括同种类生物细胞、不同种类生物细胞进行融合；②仅在两个细胞的接触点照射激光，作用于细胞的应力和障碍小，对细胞损伤小；③可进行远距离的无菌操作，融合成功率高。

图4-7　激光细胞融合过程

激光细胞融合法是利用激光镊子把两个细胞“拉拢”，让彼此靠近并接触在一起，如图4-7（a），（b）所示，随后利用另外一束直径很微小的激光微束，沿两个细胞接触的地方照射，击穿这两个细胞在接触地方的细胞膜，亦即在这两个细胞上各形成一个小孔，随后它们将通过其上开的小孔相互交换细胞质。细胞质膜上产生微孔是一个可逆的过程，在微孔处细胞质膜的表面曲率很大，使细胞质膜处于高张力状态，以致两个细胞在接触处的边缘逐渐模糊，不久便观察不到两个细胞的边缘，变成哑铃状，如图4-7（c）所示。其次，细胞有自行修复的功能，在细胞上形成的小孔会很快收缩并自行闭合，细胞由哑铃形状逐渐变为圆球状，这两个细胞便融合在一起了，形成了一个新细胞，如图4-7（d）所示。

影响激光细胞融合效果的因素很多，除温度等环境因素外，主要还有激光参数和激光对细胞照射位置等。

1）激光能量密度(www.zuozong.com)

激光细胞融合通常使用脉冲激光，对细胞或组织的显微外科手术使用的激光能量有一个适宜范围，激光能量密度过低将不足以在细胞质膜产生微孔，达不到融合的目的；而激光能量密度过高将使细胞质膜产生永久性微孔，造成原生质体内物质外溢而导致细胞死亡。因此，在进行细胞融合时需要选择合适的激光能量密度，既满足细胞融合的需要，又不致损伤细胞活性，至少不能把细胞给打破。为实现激光细胞融合，使用的激光功率密度也需要达到一定数值，且存在一个临界激光功率密度，过高也会损伤细胞。

2）激光照射时间

用不同能量密度的激光聚焦到细胞上时，都有一个相应的激光阈值作用时间，照射时间小于阈值作用时间，细胞膜不会破裂。虽然由于细胞的个体差异，造成与每一激光功率相应的细胞被破坏阈值的作用时间波动较大，但激光能量密度与照射阈值作用时间有一定规律：在激光能量密度与照射阈值作用时间的关系曲线上出现明显的拐点，当激光能量密度小于某个数值时，细胞破裂的阈值作用时间随能量密度的增加变化较快；而能量密度大于这个值时，细胞破裂的阈值作用时间随能量密度的变化趋于平缓。同时，存在一个合适的作用时间，在这个作用时间内得到最高融合率，延长或缩短作用时间都会使融合率降低。此外，对于比较低的激光能量密度，无论激光作用多长时间，甚至细胞膜破裂，也没有发生融合现象，这显示激光细胞融合存在阈值激光功率密度，只有当激光的功率达到阈值功率以上时，融合现象才会发生。

3）激光微束作用位点

除了激光参数的选择，激光细胞融合另一个关键是激光在细胞作用位点的选择。在激光细胞融合工作中，激光束一般需要作用在两个细胞的紧密接触区，而将激光的焦点定位于细胞的紧密接触区域，要求相当准确的位置操作性。