植物的组织培养技术课题研究

——番茄无菌苗的培养

●教材原有实验简介

在人教版高中生物教材选修一中，专题三《植物的组织培养技术》包括两个课题——《菊花的组织培养》和《月季的花药培养》。每个课题都分成三部分：第一，基础知识，介绍组培的基本过程和影响因素；第二，实验操作，包括制备培养基、消毒、接种、培养、移栽、栽培；第三，结果分析与评价。在实验操作中，教材介绍了氯化汞加酒精的消毒方法，并且因为菊花易于培养，没有加入植物生长调节剂。

在人教版高中生物教材选修三中，专题二《细胞工程》有实验《胡萝卜的组织培养》。该实验包括：实验原理、实验目的、材料用具、方法步骤、讨论五部分。在实验操作中，教材介绍了酒精加次氯酸钠的消毒方法，没有提到培养基是否加入植物生长调节剂。

学生已经进行的组培实验说明，胡萝卜作为外植体有污染率高（可能是因为胡萝卜存在细胞内生细菌）的问题，而且愈伤组织难以进一步分化。

●本实验改进之处

我校校本课程对组培实验做了以下改进：

1.课时增加为4～5课时。其中第1～3课时做长寿花，第4、 5课时做番茄，两部分的内容相对独立，可根据实际情况增减课时。

2.第4课时学生以番茄种子为外植体接种到发芽培养基，以获得无菌苗。种子的消毒比其

他器官更容易，无菌苗脱分化产生愈伤组织也比较容易。

●课前准备

1.材料

外植体（番茄果实或种子）、灭菌MS培养基（含不同浓度的植物生长调节剂）。

2.药品

10%～12%过氧化氢溶液、无菌水、5%次氯酸钠溶液、70%酒精、1g/L的果胶酶溶液。

3.用具

注射器、镊子、解剖剪、解剖刀、工具架、烧杯（内装75%酒精棉球）、灭菌培养皿（每人6套）。

4.设备

超净工作台、酒精灯、火柴、废物缸、 白大褂、鞋套、接种灭菌器。

●教学目标

1.知识技能

（1）了解植物组织培养技术在生产中的应用。

（2）了解影响植物组织培养的各种因素。

（3）掌握培养基制备、外植体消毒、接种、培养等基本操作技术

2.过程方法

（1）练习外植体（番茄种子）的接种技术。

（2）学习并实践无菌操作技术。

3.情感态度价值观

培养学生沟通与交流能力，体验科学研究严谨认真的科学态度。

●课时建议

1课时

●教学过程

一、复习导入

1.实验原理（植物细胞具有全能性）

2.相关概念

外植体——离体的植物器官、组织或细胞，如胡萝卜根、番茄种子等。

脱分化——去除外植体原有的分化性状，重新进入新的发育分化状态。

再分化——脱分化产生的愈伤组织继续培养，可以重新分化成根或芽等器官。

二、教师讲述以下准备工作

1.实验前20min接种室紫外灯照射消毒10min。

2.实验前打开超净工作台的风机和紫外灯，关闭挡风玻璃，消毒10min。

3.外植体表面清洗。实验当天从成熟的西红柿果实中取出种子，用自来水冲洗3次。配制浓度为1g/L的果胶酶溶液，浸泡种子5～10min，去除果胶。如果用市售番茄种子，需要提前24小时用清水浸泡种子。(www.zuozong.com)

三、教师示范以下操作

1.用肥皂洗手，洗净手腕。

2.换上白大褂，套上鞋套。

3.关闭接种室和超净工作台的紫外灯，打开超净工作台的照明灯，向上拉开挡风玻璃，开口至1/4处。

4.把培养基放在超净台的两侧，把镊子、解剖剪、解剖刀插入接种灭菌器中。

5.用沾有75%酒精的棉球擦手和超净工作台表面。

6.待工作台和手上的酒精挥发完后，点燃酒精灯。所有接种的操作都必须在酒精灯火焰10cm的范围内进行操作，每次用完器械后，都需要用火焰灼烧灭菌。

7.外植体（番茄种子）表面消毒。用10%～12%过氧化氢浸泡5～15分钟，无菌水漂洗三次，转到次氯酸钠浸泡6～10分钟，无菌水漂洗三次；用70%酒精浸泡10～30秒，无菌水漂洗三次。每次均用注射器抽掉用过的液体，并且每次漂洗均需更换培养皿，培养皿不重复使用。

8.将洗净的材料放到灭过菌的培养皿中。左手拿着锥形瓶，倾斜瓶口，右手拉开封口膜上的皮筋，并将封口膜攥在左手中。

9.右手在酒精灯外焰上灼烧镊子，待镊子冷却后，把种子用镊子夹到锥形瓶里，放在培养基表面，每瓶放5粒，包好封口膜。

10.把用过的镊子随即插入接种灭菌器中，进行下一瓶的接种工作。

四、学生操作，教师巡视指导

完成接种后，在无光条件下培养，至发芽，转移到自然光下培养，得到无菌苗。每周观察记录一次外植体生长情况，统计结果。

●板书设计

学生实验报告

植物组织培养实验记录表

班级 _________　姓名 _________　实验日期_________

培养基：琼脂　　g/L　　蔗糖　　g/L　　MS　　g/L

植物激素：mg/L　　　mg/L　　　标签号码　　　　颜色

第1次观察记录

实验结论：

思考题

结合实验的过程，请你说一说为什么无菌技术是植物组织培养能否获得成功的关键？你在实验中有哪些相关做法值得借鉴或改进？

●学生评价方案

●实验成果展示

小资料

1.外植体消毒

植物组织培养所用的材料，大部分取自田间或开放的自然条件下，材料表面附着大量的病菌，如消毒不彻底，接种后会立即发生污染。所以在接种前，要根据培养植物的种类、取材部位、材料表面的处理程度和材料的大小等特点，确定适宜的消毒时间，进行彻底的表面消毒，以提高外植体初代培养的存活率。就一般规律而言，材料体积越大，表面附着物愈多愈厚，表面处理较粗时，宜延长消毒时间，以利于消毒液体穿透表面污染层，才能达到杀菌的目的，反之则应相对缩短消毒时间，避免杀死外植体本身。如用0.1%升汞（HgCl）消毒处理生长茎尖时，需消毒3～5min，但消毒生长茎段时，则需10min以上才能达到一定的消毒效果。

2.继代转接的无菌操作

经过接种获得无菌试管材料之后，必须经过数次的继代培养进行增殖，当分化数量达到试验（或生产）要求时，即可进行生根培养。在一系列的接转过程中，有时也由于操作不慎，会造成直接、大量的污染而难于控制，尤其是在空气湿度较大的夏季，会造成大面积的真菌污染，所以，在整个培养过程中，每次继代转接，必须小心谨慎，仔细操作。超净台及各种工具的消毒务必全面而彻底，保证试管材料接触的工具与空间绝对无菌化。接种用工具每次消毒后，使用的时间不宜太长，次数不能太多，一定要及时用酒精灯表面消毒。材料的转接要迅速快捷，尽量缩短材料在试管外的停留时间。总之，整个转接过程要求迅速而准确，才能降低或防止材料的污染，提高存活率。

3.生根材料的驯化

由于试管苗是在高湿、弱光、近于恒温的条件下培养形成的，其形态结构不健全，有些生理机能尚未形成，如果此时移至瓶外培养，必然由于抗性低下而死亡。因此为使小苗能够尽快适应瓶外环境，首要条件是温度，最高温不能超过28℃ ，也不能造成叶片的长时间萎蔫与灼伤；其次是湿度，保证苗际周围的湿度变化是一个渐进的过程，防止叶片失水死亡；再就是适当增加光照强度，促进植株由异养向自养转化，这样经过一段时间的驯化，可有效地提高试管苗外移的成活率。【郭恩才.植物组织培养中的重要环节［J］.河北果树，2003（4） ：36-36.】

参考文献

［1］义务教育教科书生物学（八年级上册）［M］.北京：人民教育出版社，2014.

［2］生物技术实践［A］.普通高中课程标准实验教科书：生物选修1［M］.北京：人民教育出版社，2007.

［3］现代生物科技专题［A］.普通高中课程标准实验教科书：生物选修3 ［M］.北京：人民教育出版社，2007.

［4］甘中祥，李倍金，张录霞，齐树森，彭刚.加工西红柿未成熟种子培养［J］.北方园艺，2012 （05） ：137-138.

［5］赵新涛，宿烽，都彦伶.圣女樱桃西红柿再生体系的研究［J］.山东农业科学，2015，47（3）：13-17.