探究长寿花继代培养和试管开花的条件

●教材原有实验简介

在人教版高中生物教材选修一中，专题三《植物的组织培养技术》包括两个课题——《菊花的组织培养》和《月季的花药培养》。每个课题都分成三部分：一、基础知识，介绍组培的基本过程和影响因素；二、实验操作，包括制备培养基、消毒、接种、培养、移栽、栽培；三、结果分析与评价。在实验操作中，教材介绍了氯化汞加酒精的消毒方法，并且因为菊花易于培养，没有加入植物生长调节剂。教材只介绍了初代培养，没有继代培养。

在人教版高中生物教材选修三中，专题二《细胞工程》有实验《胡萝卜的组织培养》。该实验包括：实验原理、实验目的、材料用具、方法步骤、讨论五部分。在实验操作中，教材介绍了酒精加次氯酸钠的消毒方法，没有提到培养基是否加入植物生长调节剂。教材也是只介绍了初代培养，没有继代培养。

●本实验改进之处

我校校本课程对组培实验做了以下改进：

1.课时增加为4～5课时。其中第1～3课时做长寿花，第4、 5课时做番茄，两部分的内容相对独立，可根据实际情况增减课时。

2.第二课时为探究实验设计，学生阅读相关文献后提出适宜长寿花快繁和试管开花的最佳激素浓度比例及其他条件的假设，并配制含有不同浓度的植物生长调节剂的灭菌MS培养基。

●课前准备

MS培养基（含蔗糖和琼脂，已煮沸，每人500mL）、三角锥形瓶（每人10瓶）、封口膜、皮筋、植物生长调节剂溶液（6BA和NAA）、玻棒、1N的NaOH溶液、1N的HCL溶液、pH值试纸、量筒、滴管。

●教学目标

1.理性思维

学习和研读植物组织培养相关文献资料，运用理性思维方法展开探讨与分析，训练学生获取信息能力与逻辑思维判断能力。

2.科学探究

基于本实验目的设计实验探究适宜的长寿花快速繁殖和试管开花的最佳激素浓度比例及其他条件。

3.社会责任

帮助学生树立严谨求实的科学态度。

●课时建议

2课时

●教学过程

第一，检查上一课时接种的长寿花外植体是否成功，在实验报告单上完成数据记录。

第二，每人查阅一篇文献，阅读后，完成研读记录， 由1～2名同学统计所有文献的记录，并投影出结果，归纳适宜的长寿花快繁和试管开花的最佳激素浓度比例范围及其他条件。每1～2名同学认领其中一组实验条件。(www.zuozong.com)

第三，配制本组所需培养基。计算本组所需的植物生长调节剂溶液（6BA和NAA）的量，加入培养基，搅拌均匀，调节pH值至5.8左右，分装至三角锥形瓶，封口，灭菌待用。

●板书设计

学生实验报告

论文研读记录及实验设计表

经讨论，本组确定的激素浓度比例如何？其他条件如何？

●学生评价方案

●实验成果展示

小资料

激素在细胞分化中的调控作用

激素在植物生长发育中具有重要的调控作用，也是离体培养条件下调控细胞脱分化和再分化的主要因素，其中生长素和细胞分裂素是两类主要的调控培养条件下细胞生长和分化的植物激素。此外，在有些试验中也显示，赤霉酸（GA3）、脱落酸（ABA）和乙烯（ETH）等也在细胞分化中起到一定的调节作用。早期实验表明，生长素能刺激木质部的发生。1949年，法国植物学家Camus把一种菊苣小的营养芽嫁接在其根的组织培养物的上表面，几天以后，处于芽下的薄壁细胞中分化出了维管束。这些维管束与芽的维管组织相接在一起。 同时，他在愈伤组织表面放置一片玻璃纸，在玻璃纸上再放置芽，切断了愈伤组织与芽之间的直接接触，结果维管组织的分化依然发生。这个试验表明， 芽对维管组织的分化有刺激作用，这种刺激作用必然是由一种或几种扩散性的化学物质引起的。1955年，Wetmore和Sorokin进行了另一试验，证明上述有刺激作用的物质是生长素。他们采用洋丁香未分化的愈伤组织为试验材料，设计了两个试验处理，一是取一块愈伤组织，上面开一个“V”型缺口， 另将一营养芽下端削成楔形，嵌在愈伤组织的缺口中，经过20～30 d的培养，处在芽下面的愈伤组织细胞在芽的诱导下发生分裂，然后先由一些细胞形成了若干短的立柱状结构，后来即发育成维管组织。 另一处理是将愈伤组织接种在含有蔗糖和生长素的琼脂培养基上， 同样能有效地诱导维管组织的分化，从而直接证明了生长素对维管的分化作用。 以后的试验证据表明，细胞分裂素也与木质部的发生有关。1964年Bergmann证明，若在含有5%椰子汁的培养基中加入一定浓度的激动素，可使烟草愈伤组织的导管分化提高30%。 以后众多的植物离体培养也证明，细胞分裂素和生长素对于细胞生长和分化具有同等重要的作用。进一步研究证实，生长素和细胞分裂素对于细胞生长与分化具有协同作用，它们的量与比值的不同配合，对细胞分化起着重要的调节作用。在已知含有不同激素水平的胡萝卜外植体的培养体系中，生长素和细胞分裂素对于胡萝卜细胞分化同等重要。然而， 由于外植体本身内源激素水平的差异，从而对外源添加这两种激素的培养反应不同，从而解释了在不同研究中所报道的外源激素对培养物影响差异较大的原因（Mizuno和Komamine， 1978）。在离体条件下，如果用生长素和细胞分裂素处理的顺序不同，其作用也不一样。如果先用生长素处理，后用细胞分裂素处理， 则有利于细胞分裂而不利于细胞分化。反之， 则有利于细胞分化。如果两者同时处理， 则可提高分化频率。在菊芋（Helianthus tuberosus）块茎培养中发现，细胞分裂素对细胞分化的作用在于它能提高生长素作用的敏感性。

尽管近年来由生长素和细胞分裂素诱导表达的基因已在许多植物或培养物中克隆出来，但有关生长素与细胞分裂素在离体培养中的协同作用机理仍不十分清楚。Dominov等（1992）从一个烟草（Nicotiana plumbaginifolia）的悬浮培养细胞系中分离到一个同时可被生长素和细胞分裂素诱导表达的cDNApLS216。诱导表达试验显示，加入生长素（2， 4-D， 2， 4-苯氧乙酸）只引起pLS216mRNA的短暂积累，而同时加入外源BA则可引起转录积累， 虽发生时间较迟，但可持续转录。 因此他们也认为，细胞分裂素可能增加了细胞对生长素的敏感性，或者能阻断生长素的反馈抑制。在另一个生长素诱导表达基因p48H-10的调控研究中，也证明细胞分裂素在细胞分化中的作用是通过增强生长素的作用实现的。在百日草叶肉细胞培养中，单独使用IAA时，在培养48h后才检测到p48H-10的表达， 而与BA同时使用时，培养24h即可检测到该基因的表达，只使用BA则不能启动该基因的表达。组织印迹检测显示，p48H-10只在茎和根的维管束中表达， 而在分生组织中不表达（Ye和Varner， 1994）。这一结果较直接地证明了生长素与细胞分裂素在细胞分化中的协同调控作用。

除了生长素和细胞分裂素外，赤霉素（GA）、 乙烯和脱落酸等植物激素在细胞分化中的作用也有报道。但是，在培养条件下，这些激素的作用在不同的实验中往往出现较大的差异，有些甚至是完全相反的结果。 因而认为， 它们在离体培养中并不是必需的基本调节物质。近年来亦有研究认为，BR（brassinosteroid，油菜素内酯）可能在细胞分化中具有一定的作用，特别是在百日草TE细胞分化中，可检测到BR的大量增加（Yamamoto 等， 2001）。拟南芥、豌豆以及番茄等作物的BR缺乏突变体发育研究表明，BR生物合成途径阻截的突变体，在形态上均出现不同程度的畸形变异（Altmann， 1999； Li和Chory， 1999）。 到目前为止， 已在60种植物中鉴定出40种不同类型的BR。然而，在许多植物外源饲喂BR的试验中发现， 由于植物组织以及培养条件的不同，各种类型BR所表现出的生理活性和功能有较大差异。因此，BR作为离体培养中生长和发育调控的基本激素， 目前还没有一个稳定的分子形式。越来越多的研究显示，植物激素对细胞生长与分化的调控是一个复杂的级联调控过程。应该注意到的是，在植物中细胞种类的不同或同一种细胞不同的发育状态，均会影响细胞对激素的反应。 因此，在离体培养条件下， 由于外植体细胞所处的生理状态不同，其内源激素水平也存在较大差异，试图寻找外源激素水平在分化中作用的共同模式可能是很困难的。

细胞脱分化和再分化是离体培养过程中细胞全能性表现的基本过程， 了解这一过程的调控机理，最终是为再生个体奠定基础。生物个体形成是通过形态发生（morphogenesis）实现的，建立在离体培养基础上的形态发生称之为体细胞形态发生（somatic morphogenesis）。体细胞形态发生过程及其调控机理是细胞工程学研究的核心内容。与个体水平上的形态发生不同，培养条件下的形态发生不是起源于合子， 而是起源于培养细胞。在培养条件下，植物细胞经过再分化形成完整个体可以通过两种途径：一是器官发.（ organogenesis），二是体细胞胚胎发生（ somatic embryogenesis）。【谢从华，柳俊.植物细胞工程［M］.高等教育出版社，2004.】

参考文献

［1］秦静远，房师梅，林必博，等.植物组织培养技术［M］.重庆：重庆大学出版社，2014.

［2］董璐.三种草本花卉试管开花组织培养技术研究［J］.中国优秀硕士学位论文全文数据库（2015）.